肝脏缺血再灌注损伤后高压氧治疗的超微结构观察
摘要：目的：了解高压氧对肝脏缺血再灌注损伤是否有保护作用及明确高压氧最佳干预的时机。方法：对兔的肝动脉阻断15分钟恢复血供后不同时期作高压氧治疗，经12天后取活体兔肝脏组织作超微结构观察。结果：高压氧对肝脏缺血再灌注损伤有明显的保护作用，并以术后立即作高压氧效果最好，3天后作高压氧仍有一定的作用。结论：高压氧对肝脏缺血再灌注损伤具有很好治疗作用，而且是越早开始治疗效果越好。
关键词：高压氧 缺血再灌注损伤 电子显微镜 超微结构
Ultrastructure observation to liver ischemic reperfusion
injury treated with hyperbaric oxygen
Department of Hyperbaric Oxygen, Xiangya Hospital,Middle-Southen University
Xiao Pingtian Xa Hongzi* Guo Hua Wu Xiaoying#
Abstract: Purpose: to understand whether the hyperbaric oxygen is effective on treating the liver ischemic-reperfusion injury and when it is better that the hyperbaric oxygen be used. Method: The liver artery of rabbit was obstructed for 15 minutes and then the artery, reperfused. These rabbits were treated with hyperbaric oxygen in different time and one of the groups was not treated with hyperbaric oxygen. The tissues of life liver of the rabbits were taken for observing with electron microscopy. Result: The best treating results happened in immediate treating group and the worst, in untreating. Conclusion: It was effective for liver ischemic-reperfusion injury treated with hyperbaric oxygen and the earlier the treatment was used, the better the result is.
Keywords: ischemic reperfusion injury，hyperbaric oxygen， ultrastructure,
electron microscopy
肝脏缺血再灌注损伤后，肝细胞因缺氧后能量代谢紊乱而发生水肿，由于水肿可进一步加重缺氧，缺氧—水肿可形成恶性循环，打破这一恶性循环关键在于已经发生水肿尚未死亡的细胞能够得到足够的氧气，使水肿细胞膜上的钠-钾泵获得能量进行工作，而要使直径增大的水肿细胞获得氧气，只有依赖有较强穿透力的高压氧。因此最好的方法是在最佳时机采用高压氧治疗（1），常压氧或包括药物治疗在内的其它疗法都不能使氧到达严重水肿的组织细胞。原因是细胞水肿后，细胞体积大，超过常压氧的穿透能力，细胞得不到氧，细胞能量代谢进一步障碍，细胞膜上的钠钾泵不能作功，细胞内的水、钠在细胞内潴留而造成水肿逐渐加重直至细胞变性坏死。具有很强穿透力的高压氧可以解决肿胀细胞的缺氧，则能阻断缺氧—水肿恶性循环。因此从理论上讲高压氧是预防和治疗肝再灌损伤的有效方法。本研究探讨高压氧是否对肝缺血再灌注损伤有治疗作用，并明确采用高压氧治疗的最佳实施时机。肝缺血再灌注损伤已有研究(2)，采用药物等办法有一定的效果，但不能解决根本问题，应用高压氧治疗脑缺血再灌损伤曾有报道（3），但用高压氧处理再灌注损伤的时机研究，以及对高压氧处理肝脏再灌注损伤的研究在国内、外尚未见报道，理论上推测如果选择了最佳高压氧处理时机，高压氧是治疗缺血再灌损伤的最佳治疗方法。本研究将对提高肝损伤的治疗效果具有重要的意义。
材料与方法
1.1 材料：动物为家兔是由中南大学实验动物中心提供。家兔9只，体重1.7~1.9公斤,雌雄不拘。高压氧舱是由冰轮氧舱厂生产。电镜为日产H-600。
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*解放军163医院普通外科 （410007）
#中南大学湘雅医学院电镜室（410008）
1.2 方法：
1-2-1缺血手术与高压氧治疗：
肝缺血再灌注损伤术：家兔术前禁食12小时，取戊巴比妥钠（3%）30mg/kg, 静脉注射。常规消毒在无菌条件下自腹正中切口入腹，于尾状叶上方用直角钳游离尾状叶与其它叶（左侧叶、左中央叶、右中央叶）之间的管道。用血管钳一并夹住血管和胆管。钳夹后，尾状叶保持原色不变，其它肝叶可见色变成暗黄紫色，10分钟后可见肝略为肿胀。与尾状叶完全不同。钳夹15分钟后松开血管钳，待肝脏颜色恢复原色（转红）即为再灌注，关腹。然后随机进行分组。
动物分组：分为5组：第1组，缺血再灌注损伤后立即高压氧治疗组2只。第2组，缺血再灌注损伤后24小时后开始高压氧治疗组2只。第3组，缺血再灌注损伤后3天开始高压氧治疗组2只。第4组，缺血再灌注损伤后无高压氧治疗组2只。1只兔子未作任何处理，只取肝组织作电镜观察。
高压氧治疗：高压氧治疗的加压和减压时间各为20分钟，稳压为40分钟，稳压压力为2ATA（0.2MPa）, 每天2次，连续治疗12天后活体取肝组织。第1至3组所采用的高压氧治疗剂量相同，只是开始作高压氧的时机不同，第1组是术后立即作高压氧，第2组是术后24小时开始高压氧治疗。第3组是术后3天开始高压氧治疗。第4组2只兔子，只作缺血再灌注损伤，不作高压氧治疗，术后12天活体取肝组织进行电镜观察。
1-2-2．透射电镜试验方法：
取材：1X1X5mm大小的新鲜肝组织；固定：2.5%戊二醛固定24h以上；清洗：0.1MPBS 洗3次X5mine; 后固定：1%锇酸后固定1h。脱水：50%, 70%, 90%, 100% 丙酮梯脱水，每级10分；浸泡：Epon812环氧树酯混合液：纯丙酮1：1，浸泡（370C）24h。包埋：环氧树酯包埋液600C包埋成块，24h.。光镜下修块定位，切2mm的半薄切片，甲苯胺蓝染色。切超薄切片：瑞典产LkB-III型超薄切片机切片，厚约500~800Å。铀铅电子染色。日产H-600电镜观察照片。
2．结果：
2-1．正常未损伤组：肝细胞内线粒体、糖原、内质网丰富，胆微管正常，肝窦内皮细胞、Diss腔及肝窦内的枯否氏细胞均正常，可见贮脂细胞及正常的肝细胞。未见凋亡细胞（见图1）。
2-2．立即高压氧治疗组：肝脏结构大部分正常，仅见部分肝细胞内内质网水肿、扩张、囊泡化，肝脏病变轻微，仅见肝细胞内少数线粒体及内质网水肿，囊泡化，部分肝细胞胞浆内可见脂褐素，肝细胞凋亡偶见（见图2）。
2-3。术后24h高压氧治疗组：肝细胞内有少数线粒体水肿、空泡化。肝组织的某些部位的肝细胞水肿严重，胆微管扩张，肝细胞核固缩，Diss腔内偶见炎性细胞，肝窦内皮细胞线粒体空泡变，2~3个凋亡细胞/片。
2-4。术后3天高压氧治疗组：肝窦扩张，肝细胞内胞浆水肿严重，内质网扩张囊泡化，肝细胞核固缩，肝细胞凋亡数5个/片。
2-5．创伤后未作高压氧组：肝细胞胞浆严重水肿，线粒体空泡变，内质网扩张，囊泡变，肝窦内较多中性粒细胞，肝细胞核固缩，凋亡的肝细胞多，（10个凋亡细胞/片）。
3．讨论：
肝脏是两套静脉系统一套动脉系统，而且肝脏耗氧量仅次于大脑，所以肝脏对缺氧的耐受性相对较差，缺氧后肝细胞发生一系列变化，从功能到结构，肝内易形成缺氧—水肿恶性循环，及时阻断这一恶性循环是防止继发性损害的关键，一旦细胞发生水肿，理论上讲高压氧是最佳治疗（1）。本研究设立的肝缺血再灌注损伤后无高压氧处理组电镜下肝细胞严重水肿，线粒体肿胀呈囊泡化，核固缩，大量的细胞发生凋亡。再灌注损伤后立即作高压氧处理可阻断一系列病理变化，高压氧处理越早病变越轻在本研究中得到证实。本研究发现肝损伤后立即高压氧治疗组，电镜观察仅偶见凋亡细胞。而损伤24小时后开始高压氧处理组肝损伤明显加重，肝细胞水肿，细胞凋亡数增多，但较无用高压氧组要轻得多。损伤后24小时作高压氧与术后3天作高压氧相比。后者病变电镜下凋亡细胞数增多。术后3天作高压氧治疗组比无高压氧治疗组的电镜变化仍明显轻，凋亡细胞相对较少，但肝细胞水肿，线粒体空泡变相似。提示高压氧治疗应以及时治疗为佳。本研究发现高压氧对肝损伤有很好的保护作用，并且治疗时机是越早越好。
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图3. 肝再灌注损伤后24小时后开始高压氧治疗：示肝细胞胞浆线粒体水肿、空泡变，内质网扩张、囊泡化，整个细胞变淡，肝窦内皮细胞内线粒体空泡变，Diss腔内见到炎细胞。（×8000）
图2. 肝再灌注损伤后立即高压氧治疗：示少数线粒体空泡变（×8000）
图1. 正常肝细胞，肝窦及贮脂细胞（×8000） 此主题相关图片如下：
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图4.肝再灌注损伤后3天开始高压氧治疗：示肝细胞胞浆严重水肿，肝细胞核染色质浓染成块（×8000）
图5. 肝再灌注损伤后无高压氧治疗：示肝细胞胞浆严重水肿，内质网扩张囊泡化，核固缩变形。（×8000）
参考文献：
1.肖平田，生态圈 中华实用医学杂志 2002，4（24）43-44
2.唐利立等，家兔肝脏持续及间断缺血损伤的比较和SOD的保护作用，湖南医科大学学报1992，17（2）121-123
3.周建光等。高压氧对脑缺血再灌注海马CA1区神经元凋亡作用的研究。中国应用生理杂志，2001，（1）82-84
