高压氧对荷瘤鼠淋巴细胞功能的影响lg...

摘  要

 目的 探讨高压氧暴露对淋巴细胞功能的影响。 方法 用雄性Balb/C小鼠接种S-180腹水癌细胞，制成免疫功能低下动物模型。经HBO暴露，摘眼球取血标本观察淋巴细胞-肿瘤花环率、淋巴细胞计数、淋巴细胞百分比；用ELISA双抗夹心法测定小鼠血清IgG浓度；用3H-TdR掺入法测定脾淋巴细胞增殖；用同位素靶细胞释放法观察NK细胞杀伤活性和LAK细胞活性；取脾脏观察小鼠脾指数的变化。结果1)淋巴细胞-肿瘤细胞花环率在肿瘤HBO处理组(D)明显高于对照组(A)(P<0.01)，在肿瘤HBO处理组(D)明显高于单纯HBO处理组(B)(P<0.05)。2)淋巴细胞计数(LC)在各组之间均无明显变化。3)淋巴细胞百分比(LP)在对照组(A)分别比肿瘤HBO组(D)和单纯肿瘤组(C)高(P<0.001；P<0.05)，在单纯HBO组(B)比肿瘤HBO组(D)高(P<0.01)。4)IgG测定在各组间无统计学差异。5)淋巴细胞增殖在HBO组(B)比正常对照组(A)低(P<0.01)，在肿瘤组(C)比对照组(A)低(P<0.01)，在肿瘤HBO组(D)比肿瘤组(C)低(P<0.01)，在肿瘤HBO组(D)比HBO组(B)低(P<0.01)，在肿瘤组(C)比HBO组(B)低(P<0.01)。6) NK细胞活性在单纯肿瘤组(C)比对照组(A)低(P<0.05)，在肿瘤HBO组(D)比单纯肿瘤组(C)高(P<0.05)，在HBO组(B)比对照组(A)有降低的趋势(P=0.07)。7)LAK细胞活性在肿瘤组(C)比对照组(A)高(P<0 05="" 8="" p="">0.05)。结论  压力为0.2MPa，氧浓度为87%的HBO暴露和/或肿瘤接种对淋巴细胞功能的作用是多方面的，有的部分增强，有的部分减弱，值得进一步研究。

关键词  高压氧   淋巴细胞增殖   天然杀伤细胞   LAK细胞   IgG     脾指数    肿瘤

The effects of hyperbaric oxygen on the part function of lymphocyte in tumoer-bearing mice

Liu Qingle, Hang Xiaohua, Qian Binglong, et al.

Medical Center of Hyperbaric Oxygen , Second Military Medical University, Shanghai, China 200433

ABSTRACT  Objective To explore the influence of hyperbaric oxygenation (HBO) on lymphocyte function. Methods Making tumour-bearing model by injecting S-180 cells to male Balb/C mice. After HBO exposure, got blood samples by enucleating eyeballs of the mice and lymphocyte-tumour cell rosette rates, lymphocyte count and percentage were observed. The IgG concentration in the blood serum was assayed by established an ELISA method. The proliferation of spleen mononuclear cells to mitrogen Con A by 3H-TdR uptake, the cytotoxicity of nature killer cells and LAK cells by 3H-TdR target cells released and the index of spleen of the mice were observed. Results  The lymphocyte-tumour cell rosette rate in HBO with tumour group was separately higher than that in contrast group (P<0.01) and HBO group (P<0.05); lymphocyte counts have no change in various groups； the percentage of lymphocytes in white blood cells is higher in contrast group (A) than that both in HBO-tumor group (D) and in tumor group (C) (P<0.001； P<0.05), and higher in HBO group (C) than that in HBO-tumor group (D) (P<0 01="" the="" igg="" concentrations="" in="" the="" blood="" serum="" were="" not="" markedly="" changed="" in="" various="" groups="" p="">0.05). The proliferation of spleen mononuclear cells in HBO group and that in tumour group were respectively lower than that in control group (P<0.01, P<0.01), and that in HBO-tumour group was separately lower than that in tumour group (P<0.01) and in HBO group (P<0.01). The cytotoxicity of nature killer cells in control group was higher than that in tumour group (P<0.05), and that in HBO-tumour group was higher than that in tumour group (P<0.05), and that in HBO group was of tendency to lower than that in control group (P=0.07).           The cytotoxicity of LAK cells in tumour group was higher than that in control group (P<0 05="" the="" index="" of="" spleen="" in="" various="" groups="" was="" no="" changed="" p="">0.05). Conclusion            The effect of HBO(87%O2, 0.2MPa) on immune system is variable-some of the functions are strengthened and some of them, suppressed.

Key words  Hyperbaric oxygenation  Immune  Neoplasm Nature killer cell   Lymphocyte   IgG   Index of spleen       LAK cell

高压氧对免疫功能的影响一直引起中外学者的广泛兴趣(2,3,5-7)。虽然因使用的研究方法和对象不同，有不同的研究结果，但许多学者认为，高压氧对免疫功能有不可忽视的作用。我们用荷瘤鼠模型经高压氧暴露后，对淋巴细胞及其有关功能做了观察。

材料与方法

一、动物及分组

Balb/c纯系小鼠，雄性，鼠龄40天，体重18+0.5g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。随机分成4组。A组为正常对照;B组只行高压氧暴露;C组做肿瘤接种;D组接种肿瘤并行高压氧暴露。

二、试剂与细胞

　　RPMI-1640培养液（Gibco产品），小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所产品），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂生产，批号930712），3H-TdR（比度1.18×1012Bq/mmol/L）由中国科学院上海原子核研究所生产（批号950627），Con A（中科院上海生化所东风生化技术公司，批号9407211），兔抗小鼠抗体和辣根过氧化酶标记抗体（长海医院免疫室提供），DEAE-Sephadex A-50（上海试剂公司），IL-2(上海克隆高科技研究所)；小鼠淋巴瘤细胞株（YAC-1），小鼠淋巴肉瘤细胞株（EL-4），小鼠腹水癌细胞株(S-180)均由长海医院疫室提供。

三、主要仪器和设备

CO2培养箱（美国），倒置显微镜（OLYPOUS，日本），液体闪烁仪（美国），ZT－Ⅲ型微量细胞样品收集器（绍兴东浦医疗仪器厂），低温冰箱（得贝），Dｙｎ－1640型细胞计数仪（美国），BSZ-100自动部分收集器（上海沪西仪器厂），动物高压氧舱(上海杨园医用氧舱厂)。

四、肿瘤接种

　　将S-180细胞用1640营养液配制成浓度为2×107个/ml的瘤细胞混悬液，取0.1ml细胞数约2×106个接种于C、D两组动物背部正中皮下。

五、高压氧暴露

将鼠置于动物加压舱内，压力为0.2MPa，氧浓度为87%，每次暴露60分钟，每日1次，共20次。

六、淋巴细胞-肿瘤细胞花环率测定

　  用淋巴细胞分离液，分离淋巴细胞(纯度98%)，再用Hanks液配成1×107/ml。取培养的S-180瘤细胞悬液0.05ml(2×106/ml)，加0.05ml新鲜血清混匀，加0.05ml小牛血清和0.05ml淋巴细胞悬液混匀，涂片后Wright染色，计100个癌细胞。按一个癌细胞结上2个或以上淋巴细胞为一个花环，算出花环率（1）。

七、LC、LP测定

    摘眼球取血，用微量刻度吸管取鼠血20ul在色杯中比色，测定Hb含量；另取血一滴于清洁载玻片上，推片，显微镜下计数，测定LC、LP。

八、Con A淋巴细胞增殖试验

制备脾单个核细胞悬液，配制不同浓度的Con A液，3H－TdR(7.4×105 Bq /ml)标记后测定淋巴细胞增殖能力（2）。

九、NK细胞杀伤活性的测定

将培养的NK敏感细胞株YAC-1细胞，在指数分裂期行同位素3H－TdR标记。以脾单个核细胞悬液为效应细胞，同位素标记后的YAC-1细胞为靶细胞，调整适当的效靶比，在液闪仪下测cpm值（2）。

十、LAK细胞的测定

使用敏感细胞株EL-4为靶细胞， 3H－TdR掺入，液闪仪中测cpm值。

十一、酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测血清IgG

取小鼠血清用饱和硫酸铵盐析法提取γ－球蛋白，纯化收集后用紫外分光光度法测OD值，计算IgG蛋白含量。

十二、数据处理

   数据用 X±s表示。采用组间t检验。

结   果

一、  淋巴细胞-肿瘤细胞花环率  A、B、C、D各组淋巴细胞-肿瘤细胞花环率(X±SD)分别为：5.2±2.5%；8.2±2.4%；9.2±6.0%；19.8±7.2%。T检验示：肿瘤HBO处理组(D)的肿瘤细胞-淋巴细胞花环率明显高于对照组(A)(P<0.01);肿瘤HBO处理组(D)的肿瘤细胞淋巴细胞花环率明显高于单纯HBO处理组(B)(P<0.05)。见图1 (n=5)。
 
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二、淋巴细胞计数(LC)      A、B、C、D各组淋巴细胞计数(X±SD, 1´106)，分别为：3.69±1.3；2.75±0.6；2.99±1.3；2.86±1.0。T检验示：各组之间均无明显变化。见图2 (n=5)。
 
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三、淋巴细胞百分比(LP)        A、B、C、D各组淋巴细胞百分比(X ±SD)，经换算分别为：78.2±11.0％；68.8±5.5％；41.4±12.5％；27.4±8.4％。T检验示：对照组(A)分别比HBO肿瘤组(D)和单纯肿瘤组(C)高(P<0.001;P<0.05)；单纯HBO组(B)比HBO肿瘤组(D)高(P<0.01)。见图3 (n=5)。

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四、T淋巴细胞转化     测定结果  A、B、C、D各组的cpm值(X ±SD)分别为22338±6346、13272±1792、5515±1612、2864±1098。经检验发现：淋巴细胞转化率在HBO组(B)比正常对照组(A)低(P<0.01);肿瘤组(C)比对照组(A)低(P<0.01);HBO肿瘤组(D)比肿瘤组(C)低(P<0.01);HBO肿瘤组(D)HBO组(B)低(P<0.01);肿瘤组(C)比HBO组(B)低(P<0.01)。见图4。

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五、HBO对荷瘤小鼠NK杀伤活性的影响       A、B、C、D各组NK细胞的杀伤活性(X ±SD)，经换算分别为：40.26±5.64％；33.71±6.87％；28.9±8.16％；39.99±9.23％。T检验示：A组脾细胞NK活性比C组高(P<0.05)；D组比C组高(P<0.05)；B组的NK活性比A组有降低的趋势(P=0.07)(见图5)。
 
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六、脾指数的测定       A、B、C、D各组的脾指数(X ±SD)％分别为:0.63±0.18%； 0.55±0.25％；0.7±0.26％；0.85±0.4％。各组之间无明显的差异(P>0.05),见图6。

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七、LAK细胞活性测定结果  A、B、C、D各组LAK细胞活性测定结果(X ±SD)％分别为:7.12±4.24%； 13.45±6.47%；17.91±7.86％；14.73±8.33%。经T检验：肿瘤组(C)比对照组(A)高(P<0.05)。见图7 (n=7)。

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