CANCER CEll：氧化应激反应促进胃癌转移？这主要通过Keap1 Nrf2轴实现！lg...

 胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤。抗氧化活性被认为是异位癌发生的可能机制。因此，氧化应激调节正在被评估为癌症治疗。有研究表明氧化应激通过影响关键效应蛋白的表达从而参与GC进程。ROS是人类和小鼠胃癌发生中的激活因子。核因子红系2相关因子2（Nrf2）与抗氧化反应元件(AREs)的增强子序列结合以调控各种抗氧化酶的表达水平，包括谷胱甘肽s -转移酶和NAD(P)H醌脱氢酶1 (NQO1)。在许多类型的癌症中，包括膀胱癌和肺癌，构成性Nrf2的稳定和激活与患者的不良预后相关。

      Nestin是一种具有抑制血管生成能力的中间丝蛋白，被当做新形成血管特异标记物和治疗靶点。Nestin可作为恶性肿瘤血管生成的特异性标记物，特别是在结直肠癌和前列腺癌中。与CD34表达水平相比，Nestin在微血管密度中的表达水平被认为是一种更敏感的延长生存期的标志物。本研究确定了Nestin在胃癌发生过程中对体内肿瘤形成和体外肿瘤表型(增殖和转移)的影响及其机制。Keap1 Nrf2轴参与了nestin调节的抗氧化反应和GC的肿瘤表型(增殖和转移)。研究结果表明Nestin Keap1 Nrf2通路可作为抑制恶性GC表型的增殖和转移的一个靶点。

近段时间青岛大学附属医院的一个团队针对Nestin Keap1 Nrf2通路开展了相关研究，确定了Nestin介导的氧化还原稳态和肿瘤表型在胃癌细胞中的作用。

      本研究共纳入22例胃癌患者和9名健康志愿者。所有患者(平均年龄55.5-10.9岁)均行手术，病理诊断为GC。患者术前未接受药物治疗，也无远处转移迹象。从9名健康志愿者身上获得了胃组织样本。样本被分离并在80℃下立即冷冻。样本由两名独立的病理学家进行诊断。人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、MKN-28、NCI-N87、MKN-45及GES-1细胞常规培养在高糖Dulbecco改良Eagle s培养基(11965084,Gibco)中，培养基中添加胎牛血清、链霉素和青霉素。培养物在37℃、5% CO2的潮湿条件下培养。在pcDNA3载体上构建Flag-Nrf2过表达载体，pcDNA3空载体作为阴性对照。在pCMV载体中构建Myc-Keap1过表达载体，pCMV空载体作为阴性对照。将细胞以5 105个/孔的密度接种于6孔板中，然后用200 ng shRNA-NC、200 ng shRNA-Nestin、500 ng pcDNA3空载体或500 ng pcDNA3- flag - nestin转染，直到细胞达到80%的融合度。转染6h后更换培养基，转染1.5 d后收集细胞。

      从GC细胞和组织样本(100 mg)中提取总RNA，测定RNA浓度和质量。进行qPCR反转录生成cDNA。进行基因表达的qPCR检测。反应条件为：95℃变性10 min, 95℃变性15 s, 60℃延伸40 s，共40个循环。以甘油醛3-磷酸脱氢酶mRNA为内参，采用2 ΔΔCT法测定靶mRNA表达水平。所有实验重复三遍。使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的放射免疫沉淀分析缓冲液(pH 8.0)裂解细胞，测定蛋白浓度，然后检测细胞增殖以及凋亡情况。采用相关检测试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)含量、总抗氧化活性、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。

                      Nestin在胃癌组织和细胞中的表达

      实验结果发现Nestin在胃癌组织和细胞系中表达水平较高。敲低Nestin基因在胃癌细胞系SGC-7901和MKN-45中的表达可降低细胞活力、诱导细胞凋亡、降低抗氧化酶的生成，并抑制胃癌转移。Nestin与Keap1结合，会导致Nrf2降解，影响下游基因表达。Nestin敲低导致胃癌细胞Nrf2表达下调。Nrf2表达的恢复或Nrf2激活物萝卜硫素的处理可以抵消Nestin敲低对GC细胞增殖、迁移、侵袭和抗氧化酶产生的抑制作用。

                   Nestin基因敲低对胃癌细胞抗氧化能力的影响

      综上所述，这些发现表明Nestin Keap1 Nrf2轴具有抗氧化应激能力，并在GC细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用。