甲烷能保护线粒体氧化损伤
2012年，匈牙利学者布鲁斯等发现甲烷具有治疗小肠缺血再灌注后炎症损伤的作用，我们随后利用甲烷生理盐水验证了这一效应，发表了数篇研究论文。但是这一研究并没有引起国际学者的大量关注。最近布鲁斯等再次发表论文，证明甲烷维持缺血后线粒体功能是甲烷产生效应的重要基础，论文刚刚发表在Plos One。
线粒体利用氧气对代谢底物进行氧化产生ATP是需氧生物细胞利用能量的重要方式，因为氧气是生物体系内电子的最终接受体，对线粒体代谢过程威胁最大因素是缺氧，这会导致ATP产生减少，代谢物的积累。给缺氧后组织恢复氧气供应是挽救组织的必须前提，但也十分危险。因为这样会迅速打破细胞内氧化还原平衡，大量还原性代谢产物来不及按照次序被氧化，过量自由电子迅速还原氧气，导致活性氧大量产生，导致自由基过度增加形成氧化应激，进一步导致离子和膜电位平衡被打破，细胞膜结构破坏，甚至细胞死亡通路被激活。
在线粒体得这一系统中，氧气是关键因素，其他一些气体分子也具有重要作用。甲烷是一种广泛分布的无生物毒性的小分子有机物。甲烷是细菌和植物的代谢产物，对哺乳动物的生理学效应研究很少，在线粒体平衡中的效益更缺乏研究。但是哺乳动物肠道内细菌可利用纤维素等碳水化合物发酵制造大量甲烷。曾经认为哺乳动物机体内细菌或非细菌产生的甲烷属于生物惰性气体，但也有一些研究提示甲烷能抑制肠蠕动，是导致人类便秘的重要因素。因为肠道内甲烷被吸收可以通过呼吸释放，因此呼吸气体中甲烷水平可作为肠道内细菌分布和活性的检查方法。一般认为呼吸气中甲烷浓度超过1ppm与肠应激综合征的便秘有相关性。
曾有研究发现，外源性补充甲烷可以纠正狗小肠缺血再灌注引起的微循环障碍和组织炎症反应。（我们和国内一些学者最近的研究发现，甲烷生理盐水能治疗肝脏、心脏、皮肤缺血再灌注引起的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等病理过程，也能对肝脏炎症反应产生保护作用）。
这些数据提示甲烷具有抗炎症作用，但是这种效应的细胞内作用分子并不十分清楚。肝脏疾病经常伴随线粒体功能障碍，而线粒体疾病也容易导致肝细胞损伤。因此，本研究将探讨通过呼吸补充甲烷对缺血后肝脏细胞线粒体功能的影响，利用肝脏缺血再灌注损伤模型，检测甲烷对肝脏组织超氧阴离子释放酶活性和线粒体电子传递链功能的影响。研究假说是组织缺血再灌注导致细胞呼吸功能障碍，甲烷通过维持线粒体功能减少活性氧产生发挥保护效应。
研究设计
动物被随机4组，缺血再灌注IR组6只，线粒体呼吸功能缺血60分钟和再灌注60分钟分别检测。对照组组织检测线粒体基础呼吸功能，左侧肝脏动脉和门静脉被钳夹诱导左叶和中叶肝脏组织缺血。缺血55分钟，分析肝脏组织缺血线粒体功能。再灌注后5、30和60分钟后分别取材。甲烷治疗组IR+CH4也是6只，除呼吸2.2%甲烷空气外，其他程序同缺血再灌注IR组。呼吸甲烷从缺血50分钟开始，并持续整个再灌注过程。假手术SH组手术程序同IR组，但不进行缺血。假手术甲烷SH+CH4组是在假手术组基础上呼吸甲烷，呼吸方法与IR+CH4一只(Fig 1)。
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血液样本进行超氧阴离子和过氧化氢水平，细胞色素c活性分析，分别在基线和呼吸甲烷后5、15、40和70分钟。组织样本最后采集处理，行TUNEL和DAPI双染色。部分组织被采集后-80°C存放（液氮后）以后进行细胞色素C和MDA分析。另外每组3只动物进行激光共聚焦显微镜活体组织学分析，确定左侧肝脏组织损伤。
研究结果
1、肝脏线粒体呼吸功能
肝脏线粒体呼吸ETC用组织呼吸测定分析仪分析肝脏组织匀浆样本(Fig 2) ，
complex II相关呼吸状态在缺血55分钟和再灌注60分钟都出现明显下降。甲烷治疗可以逆转这种改变，非常有意思的是，甲烷对假手术组肝脏组织呼吸也产生促进作用(Fig 2A)。在整个分析过程，缺血组氧化磷酸化能力都出现下降，甲烷呼吸可以在缺血55分钟和再灌注30分钟出现改善(Fig 2B)。
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细胞色素c氧化酶能代表线粒体膜损伤程度，实验用外源性细胞色素c线粒体呼吸效应为指标，发现缺血损伤能损伤线粒体内膜功能，甲烷可以恢复这种改变(Fig 2C)。细胞色素c氧化酶活性也进行了分析(Fig 3A)，甲烷可以降低导致细胞色素c氧化酶活性降低，相反缺血组再灌注时细胞色素c氧化酶活性明显增加，甲烷治疗可以逆转这种改变(Fig 3A)。
上述研究结果说明甲烷呼吸能保护肝脏缺血再灌注导致的肝脏组织线粒体功能障碍。
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缺血再灌注过程中，血液超氧阴离子和过氧化氢增加，呼吸甲烷能逆转这种改变。肝脏组织MDA再灌注后发生增加，甲烷治疗能抑制这种改变。结果说明甲烷呼吸能对抗肝脏缺血再灌注过程中氧化应激(Fig 3)。
3、组织学改变
肝脏缺血再灌注后肝脏组织细胞出现TUNEL阳性细胞增加，呼吸甲烷能减少这种细胞数量。活体组织学检测发现甲烷呼吸能减少细胞凋亡相关改变(Fig 6)。
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甲烷这种生物活性分子，在细菌层面具有重要生物学作用，近年的研究表明这种小分子有机物可能对高等动物也具有重要作用。
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0146363
